PCR 引物设计的十个基本原则
2024-07-03
PCR 引物设计的十个基本原则：
1、引物zuì好在模板 cDNA 的保守区内设计：
DNA 序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件比对，各基因相同的序列就是该基因的保守区。
2、引物长度一般在15~30碱基之间：
引物长度(primer length)常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。
3、引物 GC 含量在 40%~60% 之间，Tm值zuì好接近 72℃：
上下游引物的 Tm 值是寡核苷酸的解链温度。有效启动温度，一般高于 Tm 值 5~10℃，其 Tm 值zuì好接近 72℃ 以使复性条件zuì佳。
4、引物 3′ 端要避开密码子的第 3 位：
如扩增编码区域，引物 3′ 端不要终止于密码子的第 3 位，因密码子的第 3 位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。
5、引物 3′ 端不能选择 A，zuì好选择 T：
当末位链为 T 时，错配的引发效率大大降低，G、C 错配的引发效率介于 A、T 之间，所以 3′ 端zuì好选择 T 。
6、碱基要随机分布：
降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布zuì好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。
7、引物自身及引物之间不应存在互补序列：
引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构(Hairpin)使引物本身复性。
8、引物的 5′ 端可以修饰，而 3′ 端不可修饰：
引物 5′ 端修饰包括：加酶切位点；标记生物su、荧光、di高辛、Eu3+等，引物的延伸是从 3′ 端开始的，不能进行任何修饰。
9、扩增产物的单链不能形成二级结构：
某些引物无效的主要原因是扩增产物单链二级结构的影响，选择扩增片段时zuì好避开二级结构区域。
10、引物应具有特异性：
引物设计完成以后，应对其进行 BLAST 检测。如果与其它基因不具有互补性，就可以进行下一步的实验了。
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