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佰利莱生物给大家总结一下ELISA筛选及注意事项
2024-03-14
如何利用ELISA筛选以及ELISA方法操作的注意事项有哪些呢?相信很多做实验的小伙伴都有这样的疑问,佰利莱生物就给大家总结一下；
ELISA ,全称酶联免疫吸附实验,主要利用的是抗原抗体特异性结合的特点,可分为植接法、间接法、双抗体夹心法、竞争法等。
下面以间接法为例进行介绍:
一、方阵ELISA。用途:（1）融合后确定鼠血清中抗体效价;（2）拿到单抗腹水后,需要建立ELISA方法时先要确定包被原及抗体的优质工作浓度。
经典的方阵ELISA :将抗原和抗体各自稀释成不同梯度浓度,结果OD值P/N> 2的均判为阳性,选取OD值在1.0左右的那个Ag-Ab浓度为工作浓度,主要原因与酶标仪灵敏度有关。
但是.对于抗原抗体而言,由于它们被稀释成不同浓度,那么在理论上,每个抗原稀释度情况下 ,总有一个抗体的稀释度其OD值在1.0左右,那么到底选取哪一个OD值1.0左右的好呢 ?这就需要同时用药物做个抑制来看,哪个浓度下抑制情况好,就取哪个抗原抗体浓度做工作浓度。
二、间接竞争ELISA :在用方阵ELISA确定好抗原抗体zui佳结合浓度后就可以做间接竞争ELISA了,其目的主要是考察抗体的特异性、绘制标准曲线,计算抗体对抗原的半数抑制、检测限等参数,也可以来检测未知样品中的抗体。方法是用确定的抗原包被,在加一抗时同时加入不同浓度的标准品( 一般是药物),然后加二抗,显色。用药物(即标准品)浓度的对数为横坐标、抑制率为纵坐标,绘制ELISA标准曲线,计算相关的参数,之后就可以将未知的样品所测OD值代入曲线方程求其中抗体的含量。通常这是建立ELISA检测方法的必备项目。
标准曲线可以绘成直线或是曲线(二次方程或三次方程)。通常是选取线性比较好的几个点绘成直线。直线斜率越高说明抗体的特异性及灵敏性好, R2
值越靠近1 ,则说明线性关系好。曲线绘好后,有一些常用的参数,如抑制率、半数抑制、检测限、定量限、标准偏差、变异系数等等:
抑制率(%) =1- B/B0 ( B0为不含药物的OD值; B为含有药物的OD值)
标准差(SD) =[∑(Xi-B)2/(n- 1)] 1/2;
标准偏差( RSD) = SD/B
半数抑制:指用药物(半抗原)去做竞争实验时呈现50%抑制效果时的药物浓度。药物浓度越低,而抑制率越高,则表示抗体对药物的特异性越好,灵敏度也高。半数抑制浓度IC50对应的OD值 : OD IC50= 0.5?B0
检测下限(LOD)对应的OD值:ODLOD=B0-3SD;
定量限(LOQ)对应的OD值:ODLOQ=B0-10SD:
三、间接ELISA操作中具体注意的问题:
间接ELISA-般有6个步骤:包被抗原、封闭、加一抗(在做竞争时同时加入药物)、加二抗、显色、终止。其中除了加显色和终止外,其余步骤之间都要进行洗板。在这里面,每一步都非常重要 ,假如有一步疏忽都会造成结果的不准确。
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